CELLiGENT^® 3D 類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠套裝

Catalog No. CG0301-2、CG0301-4、CG0301-10

Specification 2ml-kit 、 4ml-kit 、 10ml-kit

Storage 根據(jù)組分保存溫度要求儲(chǔ)存. 1 年保存.

一、產(chǎn)品描述

CELLiGENT^® 3D 類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠套裝包含整套基質(zhì)膠、膠體固定液、膠體溶解液，可應(yīng)用到 3D 細(xì)胞培養(yǎng)與微環(huán)境應(yīng)用等；本試劑盒操作便利且可調(diào)控基質(zhì)膠硬度進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)測試；植物膠體可快速形成水凝膠， 請操作前詳細(xì)閱讀此使用指南。

（CELLiGENT^® 3D 類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠材料為植物來源，無動(dòng)物成分）

二、應(yīng)用

• 3D 類器官培養(yǎng)。

• 3D 細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗(yàn)

• 細(xì)胞侵襲

• 細(xì)胞遷移

• 小鼠皮下成瘤

• 適合用于 3D 細(xì)胞藥物篩檢平臺(tái)

• 細(xì)胞生長和分化

• 代謝/毒理學(xué)研究

• 體外和體內(nèi)血管生成分析

三、適用細(xì)胞種類

• 原代細(xì)胞 • 干細(xì)胞

四、試劑盒組分

五、使用步驟：

A、試劑制備

A 基質(zhì)膠：將A 基質(zhì)膠溶于 37℃水浴槽回溫 10 分鐘， 確認(rèn)完全融解.

C 緩沖溶液(1X)制備：使用前將 10X C 緩沖溶液用冰的無細(xì)胞培養(yǎng)液(例如： 無血清 DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、CELLiGENT^® 3D 類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備

全部步驟需要在無菌環(huán)境內(nèi)操作，操作步驟如下：

1. 將 24 孔培養(yǎng)板放置于冰上預(yù)冷。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后取 2×105~2×107 細(xì)胞與 0.5 毫升 37℃ 培養(yǎng)基均勻混合，并與 0.5 毫升 37℃ A 膠按照

1:1 等比例均勻混合，最終細(xì)胞密度 1*105~1*107cells/mL。

注：請選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進(jìn)行試驗(yàn)。

3. 取 20-40 微升步驟 2 含細(xì)胞的混合 A 膠溶液滴于 步驟 1 預(yù)冷的培養(yǎng)板上，膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠。注: 測試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進(jìn)行確認(rèn)。

4. 待膠體成膠后，添加 1 毫升冰的 1X C 緩沖溶液，并蓋過步驟 3 的膠溶液，固定 15 分鐘。

5. 待 15 分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細(xì)胞生長之培養(yǎng)基溶液。

6 將含有細(xì)胞的膠于 37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行 7~14 天的培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞球體的形成，按正常培養(yǎng)基更換頻率進(jìn)行更換操作。

C、溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序

小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用 1X PBS 進(jìn)行清洗。

小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的 D 緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應(yīng) 5 分鐘。溫和的用 1 毫升移液管吸取，直到膠滴完全溶解。

將含有細(xì)胞球體的溶液吸入 1.5 毫升離心管，用 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 10 分鐘，移除上清液體并收集細(xì)胞球體做分析。

D、收集單顆細(xì)胞準(zhǔn)備程序

在分離單細(xì)胞前，先按上述溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序進(jìn)行操作

1. 添加 trypsin-EDTA 并與收集的細(xì)胞球體于 37°C 混合反應(yīng)。

2. 用 1 毫升移液管混合，直到細(xì)胞體完全分解。

3. 待細(xì)胞球體完全分解，加入 3 倍體積的 1X PBS，并用 1000 轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心 10 分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細(xì)胞做分析。

E、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序

1. 準(zhǔn)備 Transwell 裝置及無血清 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液 (用于稀釋A 膠)。

2. A 膠 (2X) (貨號(hào):CG0301-A) 置于 37 ℃水浴槽回溫 10 分鐘，確認(rèn)完全融解。

3. 用無血清 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液將A 膠 (2X)稀釋 50 倍。

4. 根據(jù) Transwell 上室底部面積加入 100-120 ul/cm2 稀釋后的 A 膠稀釋液到 Transwell 上室中。

5. 將步驟 4 在 4 ℃冰箱孵育 30 分鐘。

6. 將多余的稀釋液吸出，并在 Transwell 上室中加入無血清的癌細(xì)胞系細(xì)胞懸浮液使細(xì)胞濃度約 7.5 x 104 cells/well.。

7. 在 Transwell 下室中加入含 10 %血清的細(xì)胞培養(yǎng)液做為 chemoattractant，吸引癌細(xì)胞系進(jìn)行遷移。

F、小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序

1. 將 A 膠 (2X) (貨號(hào):CG0301-A) 置于 37 ℃水浴槽回溫 10 分鐘，確認(rèn)完全融解。

2. 將C 緩沖溶液(10X) 貨號(hào):CG0301-C)與冰的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM 或內(nèi)含VEGF、heparin 的無血清 DMEM) 按 1:4 比例均勻混合配置。(例如:1 ml C 緩沖溶液(10X) 與 4 ml 無血清DMEM 混合，不可用 PBS 稀釋)

3. 將 A 膠 (2X) 與約 2*106 cells/ml 的癌細(xì)胞系懸浮液按 1:1 等比例均勻混合配置，癌細(xì)胞系懸浮液最終濃度約為 106 cells/ml。

4. 選用 21-25 G 的針頭 (避免破壞細(xì)胞)，抽取 0.2-0.3 ml 預(yù)冷稀釋后的C 緩沖溶液。(C 緩沖溶液用于 A

膠成膠反應(yīng))

5. 使用步驟 4 的同一支針管，再抽取 0.1-0.7 ml 含細(xì)胞的 A 膠混合液，在冰上孵育五分鐘。

6. 以皮下注射方式注射 0.3-1.0 ml 至小鼠。(需一次注射完含 C 緩沖溶液的 A 膠混合液) 注 1: 注射體積可依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖稣{(diào)整，若為血管生成研究注射體積需至少 0.5 ml。

注 2: 此步驟依實(shí)驗(yàn)需求可執(zhí)行或不執(zhí)行，若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果，可于注射完畢后，在小鼠

注射部位冰敷 5-10 分鐘。

7. 培養(yǎng)一至三周后可摘取接種的腫瘤組織。

注 3: 若為血管生成研究，應(yīng)注射含 VEGF 及 heparin 的 A 膠，以促進(jìn)血管生成。約三天后，可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。