為了準(zhǔn)確地進(jìn)行基因表達(dá)量分析,必須滿足只有cDNA作為模板檢出的先決條件,但Total RNA中常常混有基因組DNA,并可以直接作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增,因此會造成解析結(jié)果不準(zhǔn)確。為了避免這種情況發(fā)生,通常將檢測用引物設(shè)計在內(nèi)含子前后的外顯子上,使基因組DNA得不到擴(kuò)增。但是,此方法不適合具有單個外顯子的基因或兩個外顯子之間所跨的內(nèi)含子過小的基因,同時當(dāng)基因組上有偽基因存在時、或設(shè)計引物對基因組有非特異性擴(kuò)增時、以及基因信息沒被完全解析的生物種等也同樣不適合于本方法。在這種情況下,我們常常需要對Total RNA樣品進(jìn)行DNase I處理,以除去殘存的基因組DNA。而DNase I處理通常要進(jìn)行復(fù)雜的純化操作,同時會造成RNA的降解和損失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因組DNA進(jìn)行Real Time RT-PCR反應(yīng)的專用反轉(zhuǎn)錄試劑。Kit中使用了具有較強(qiáng)DNA分解活性的gDNA Eraser,通過42℃,2 min即可除去基因組DNA。同時由于反轉(zhuǎn)錄試劑中含有抑制DNA分解酶活性的組分,經(jīng)過gDNA Eraser處理后的樣品可以直接進(jìn)行15 min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,因此,20 min內(nèi)即可迅速完成從基因組DNA去除到cDNA合成的全過程。
使用本制品合成的cDNA適用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探針分析法,可以根據(jù)實驗?zāi)康?,選擇與SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)、Premix Ex Taq (Probe qPCR) 等定量試劑組合使用。
注意:Takara Bio使用SYBR® Green I 作為研究試劑已得到Molecular Probes Inc.的許可。SYBR®為 Molecular Probes Inc.的注冊商標(biāo)。
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■ 保存 |
-20℃。
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■ 試劑盒特長 |
1. 含有去除基因組DNA的gDNA Eraser,只需2 min即可除去基因組DNA。
2. 只需15 min即可高效合成Real Time PCR反應(yīng)用模板cDNA,是進(jìn)行2 Step Real Time RT-PCR反應(yīng)的******試劑。
3. 反轉(zhuǎn)錄引物使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer混合的RT Primer Mix,可以均勻合成樣品中的各種cDNA。
4. 本制品提供了SYBR Green®分析法和TaqMan®探針分析法各自最適反應(yīng)體系,可以根據(jù)分析方法選擇體系。?
(1) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RT Primer Mix的用量。 ?
(2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中總RNA的用量。
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5. Real Time RT PCR定量需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件就是需要將總RNA和反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋到較低的濃度。如果用 |
水或TE Buffer稀釋時,由于模板濃度低不穩(wěn)定,因而會縮小曲線范圍,結(jié)果精度降低。本制品中附加了標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用稀釋液 |
EASY Dilution (for Real Time PCR) ,將Total RNA或cDNA稀釋至低濃度時也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確稀釋,容易在寬廣范圍內(nèi)獲得準(zhǔn)確 |
定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 |
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■ 注意事項 |
1. 當(dāng)同時需要進(jìn)行數(shù)次反應(yīng)時,應(yīng)先配制各種試劑的混合液 (Master Mix;其中包括RNase Free dH2O、Buffer、酶等),然后再
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分裝到每個反應(yīng)管中。這樣可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確,減少試劑損失,避免重復(fù)分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或 |
實驗之間產(chǎn)生的誤差。 |
2. gDNA Eraser和PrimeScript® RT Enzyme Mix I 在使用前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油, |
粘度高,分取時應(yīng)慢慢吸取。同時,要使用精確、量程適合的移液槍,并且不要使Tip插入液面過深,否則會因Tip壁粘著造成 |
損失,而使酶量不足。 |
3. 5×gDNA Eraser Buffer和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 在使用前需Vortex輕輕離心。
4. 分裝試劑時務(wù)必使用新的槍頭 (Tip),以防止樣品間污染。 |