MOBIO強(qiáng)力糞便DNA提取試劑盒

美國(guó)MOBIO的PowerFecal® DNA Isolation kit為HMP（Human Microbiome Project）計(jì)劃官方推薦使用試劑盒（見(jiàn)“Manual of procedures for Human Microbime Project Core Microbiome Sampling Protocal)，專門設(shè)計(jì)用于簡(jiǎn)便快速糞便、腸內(nèi)容物、生物固體樣品微生物和宿主總DNA?；?/span>PowerSoil®DNA Isolation Kit開(kāi)發(fā)，使用了無(wú)論對(duì)土壤還是糞便樣品同樣奏效的專利抑制因子去除技術(shù)（Inhibitor Removal Technology®）。IRT技術(shù)能高效去除常見(jiàn)于糞便樣品的多糖、亞鐵血紅素和膽汁鹽等抑制因子。30min完成250mg樣品提取，純凈的最終DNA可直接用于所有下游實(shí)驗(yàn)。 

    糞便或生物固體建議加樣0.25g。樣品裝入到含有石榴石研磨珠的獨(dú)立2ml Bead Beating Tube中。在研磨珠的機(jī)械碰撞和化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的裂解作用促使下宿主、微生物細(xì)胞裂解，高效的提取效果足以應(yīng)付最難搞的微生物類型。專利的抑制因子去除技術(shù)（Inhibitor Removal Technology®）接著去掉糞便樣品中常見(jiàn)的PCR抑制物?？偦蚪MDNA吸附到硅膠濾膜上。經(jīng)過(guò)沖洗和洗脫，純凈的最終DNA可直接用于PCR、qPCR、第二代測(cè)序等進(jìn)一步應(yīng)用。
    1、采樣

    對(duì)于嚙齒動(dòng)物，最簡(jiǎn)單直接的辦法是收集糞粒。動(dòng)物關(guān)在籠子里，帶上無(wú)菌手套撿拾籠舍底面的糞粒，放入到BD Falcon 或Eppendorf Tube管這樣的無(wú)菌裝置中即可。

    收集人的糞便樣品或許有點(diǎn)臟。所以許多實(shí)驗(yàn)室提供一種桶狀的裝置，可放置在座廁下收集樣品。也可以用報(bào)紙接著樣品，以吸收更多水分。關(guān)鍵是要提供適當(dāng)指導(dǎo)，避免樣品受到廁紙或廁所壁的污染。指導(dǎo)也應(yīng)該包括建議先排尿，避免尿液污染糞便樣品。

    若要收集肛周棉拭子，確認(rèn)使用的是滅菌棉拭子，采樣風(fēng)干一個(gè)小時(shí)后放到帶帽的無(wú)菌運(yùn)輸容器，避免微生物冷凍保存前降解。

    2、樣品運(yùn)輸與保存

    樣品收集后在DNA提取前可一直放在同一個(gè)容器里運(yùn)輸和保存?；蛘叻盅b后放入到特殊滅菌收集容器中。

    若樣品是在家里自行收集的，應(yīng)把樣品容器放入到家庭冰箱中。快遞到實(shí)驗(yàn)室時(shí)用冰袋保溫。實(shí)驗(yàn)室中收集的樣品可馬上冷凍保存。HMP項(xiàng)目，要求樣品在特定的收集容器中-80℃冷凍保存，24-48h內(nèi)提取DNA。也有專家觀察到冷凍保存長(zhǎng)達(dá)一年的樣品的微生物多樣性與現(xiàn)場(chǎng)馬上提取的區(qū)別不大。 做微生物多樣性，我們的專家一致認(rèn)為，用Qiagen的RNALater這類的保護(hù)液會(huì)影響下游DNA提取，請(qǐng)避免使用。有專家觀察到使用RNALater的糞便樣品容易分層，DNA回收率下降。(糞便樣品運(yùn)輸包裝.PDF)

    重復(fù)樣品分析可以減少處理過(guò)程、稱重等環(huán)節(jié)帶來(lái)的誤差。但是在嚴(yán)格遵循******實(shí)驗(yàn)室規(guī)范、質(zhì)量管理系統(tǒng)進(jìn)行的微生物分析質(zhì)量控制和質(zhì)量保證程序下，無(wú)需重復(fù)樣品。PhloChip分析也內(nèi)建了質(zhì)量控制程序保證分析結(jié)果。

    3、分開(kāi)處理健康與患病個(gè)體糞便

    按照BSL-2規(guī)定條件分別處理健康與患病個(gè)體，包括戴好面具、手套及穿著實(shí)驗(yàn)室工作服，避免潛在病原感染。

    便秘個(gè)體糞便在后續(xù)DNA提取中需要適當(dāng)延長(zhǎng)珠磨研磨時(shí)間，稀糞需要離心去除多余液體。

    4、DNA提取

    現(xiàn)有很多種方案從糞便樣品中提取微生物DNA，而我們所有的專家都推薦使用珠磨研磨法和MOBIO的PowerSoil® DNA Isolation Kit。非珠磨研磨法無(wú)法回收格蘭性陽(yáng)性菌DNA。使用MOBIO的PowerSoil® Isolation Kit，最終洗脫DNA濃縮了為微生物DNA，PCR敏感度更高。人或動(dòng)物的真核細(xì)胞在加熱和珠磨研磨的環(huán)境下比微生物細(xì)胞更快裂解，DNA釋放游離在上清液中。游離的DNA在長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械作用力下斷成小片段，綁定吸附步驟被沖洗掉。微生物DNA保存大分子片段狀態(tài)留在硅膠離心柱上。

    我們的專家們觀察到PowerSoil® Kit這類采用珠磨研磨技術(shù)的試劑盒提取0.1g糞便樣品約可獲得100μl 2-20ng/μl 的總基因組DNA。人糞便或者腸內(nèi)容物建議加樣0.1-0.25g。較為干燥的老鼠糞便，建議減少加樣量到0.1g。推薦使用試劑盒自帶的研磨珠，沒(méi)必要另外購(gòu)買玻璃或者二氧化硅研磨珠。

有專家觀察到人糞便DNA中約有2%的人類DNA。相反，其它類型的樣品如陰道棉拭子提取的DNA最多可含80%人類DNA。

    5、去除PCR抑制因子

    糞便與土樣一樣帶有大量PCR抑制因子。抑制因子的種類因飲食結(jié)構(gòu)而異。抑制因子會(huì)吸附到離心柱硅膠濾膜上，伴隨DNA一并被洗脫下來(lái)。這類樣品的總DNA常呈黃至棕色，分光光度法讀數(shù)偏低。因此，我們推薦使用MOBIO含有抑制因子去除技術(shù)?（IRT）的PowerSoil® DNA Isolation Kit，在綁定樣品到離心柱前，去除裂解物中腐植酸、多酚、多糖、亞鐵血紅素和染料等雜質(zhì)，可獲得高純度的DNA，擴(kuò)增后得到更準(zhǔn)確的微生物群落結(jié)構(gòu)信息。